硒结合蛋白1(SBP1)抑制肝细胞癌侵袭和转移的机制研究

【摘要】肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)在全球常见恶性肿瘤中居第六位,在肿瘤相关性死亡中居第三位。虽然目前在肝癌的早期诊断、手术切除及肝脏移植方面取得了诸多进步,肝癌患者的生存率得到很大的提高,但是仍然只有30%～40%的患者适宜行根治性手术。而且即使是根治性切除,5年内仍有60%～70%的患者出现复发与转移。因此,探索肝癌发生发展及复发转移的机制,寻找有效的抑制途径与方法,已成为提高肝癌生存率的关键。硒(Selenium)是一种重要的微量元素,它对肿瘤的预防与抑制作用已经被很多研究所证实。含硒蛋白(seleniumcontainingproteins)是硒元素在体内的存在形式,不同的含硒蛋白有着截然不同的物化特性与生理功能。其中,硒结合蛋白1(Selenium-bindingprotein1,SBP1)被认为是硒元素抑癌作用的重要载体。研究已经表明许多肿瘤组织中的SBP1表达水平低于正常组织,并且与肿瘤的不良预后密切相关。但是SBP1在原发性肝癌发展预后中的作用尚无相关研究,其抑癌作用的可能机制也鲜有提及。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase1,GPX1)是另一种重要的含硒蛋白,它的抗氧化作用可以保护细胞免受氧自由基的损害,大量的研究表明它对肿瘤细胞也有着相同的保护作用。以往的研究已经发现了SBP1与GPX1之间可能存在一定的相互作用,但是并未深入探讨其在肿瘤发展过程中所起到的作用。另一方面,SBP1的表达受到缺氧诱导因子-lα(hypoxia-induciblefactor-la,HIF-la)的调控,HIF-1α是细胞面对缺氧、氧应激时重要的应答因子,它在肿瘤的进展过程中有着复杂的生物学功(?)。GPX1、HIF-1α与SBP1之间的相互联系是否与其抑癌作用相关,值得我们的研究。本研究中,我们通过比较不同恶性程度及侵袭能力的人肝癌细胞系中SBP1表达的情况,利用siRNA技术研究SBP1在肝癌细胞侵袭、迁移、增殖及凋亡过程中的作用,进一步探讨了SBP1抑癌作用的可能分子机制,并通过临床标本加以证实。最后,通过组织芯片技术,在大规模样本群中研究SBP1在肝癌组织中的表达情况及其与临床预后的关系,探讨其对临床实践的意义与作用。第一部分SBP1在人肝癌细胞系中的表达情况及其对肝癌细胞的抑制作用本部分旨在研究SBP1在人正常肝细胞系和肝癌细胞系的表达情况,并通过一系列体外实验证实SBP1对肝癌细胞的抑制作用。选用正常肝细胞系L-02和Hep3B、HepG2、Huh7、SMMC7721、PLC/PRF/5、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6共9种不同的人肝癌细胞系,通过Westernblot方法检测上述细胞系中SBP1的表达情况；从中选取SBP1高表达的肝癌细胞株SMMC7721,利用siRNA方法建立敲低组与对照组,并利用Real-timePCR、Westernblot、免疫荧光等方法加以证实；通过一系列体外实验研究SBP1敲低组与对照组之间不同的生物学特性。结果发现SBP1在正常肝细胞系中高表达,而在肝癌细胞系中,除SMMC7721外,均表现为低表达,尤其在高转移潜能的细胞系中几乎不表达。进一步的体外实验表明SBP1可以抑制肿瘤细胞的迁移,但是仅在过氧化氢处理的情况下表现出对肿瘤细胞增殖的抑制作用和对其凋亡的促进作用。研究表明,正常肝细胞高表达SBP1而大部分肝癌细胞系普遍低表达。减少SBP1的表达可以促进肿瘤细胞的迁移,同时帮助肿瘤细胞在过氧化氢处理的情况下保持增殖能力并且逃避凋亡。而在正常情况下SBP1并不表现出这样的作用,说明其抑癌作用可能与其对活性氧自由基(ReactiveOxygenSpecies,ROS)的调节有关。第二部分SBP1抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡的机制以及SBP1、GPX1与HIF-1α之间的相互作用本部分旨在探讨SBP1在特定条件下抑制肿瘤增殖、促进其凋亡的机制并建立起SBP1、GPX1与HIF-1α之间的相互作用关系。我们通过Westernblot方法检测正常条件下与过氧化氢处理下各组别SMMC7721细胞中SBP1、GPX1、HIF-lα的表达水平；利用酶活性试剂盒测定不同组别不同处理条件下GPX1的活性；利用免疫荧光双染技术研究SBP1与GPX1在各种处理条件下的相互作用。结果显示,过氧化氢的处理可以上调对照组细胞中HIF-1α与SBP1的表达,而在SBP1敲低组,同样的处理却并不能上调细胞中HIF-1α的表达GPX1的表达量在各组别之间无明显差别,但是其活性在SBP1敲低组中显著高于对照组(P<0.001)；免疫荧光提示在过氧化氢处理条件下,SBP1与GPX1均可以形成特殊的核小体(nuclearbody),并且共定位于核中。研究结果表明,活性氧自由基能够上调HIF-1a的表达,同时也会上调作为HIF-1α靶基因的SBP1的表达,而利用siRNA敲除SBP1的表达也会逆向抑制HIF-1α的表达；另一方面,SBP1虽不能影响GPX1的表达量,但是能够通过两者之间的相互作用显著抑制GPX1的活性。SBP1的抑癌作用可能是通过它对GPX1活性的抑制、对HIF-1α表达量的上调,从而调节肿瘤氧化还原微环境(tumorredoxmicroenvironment)而实现的。第三部分SBP1在肝癌组织中的表达及其临床意义研究本部分旨在探讨SBP1在肝细胞癌患者肿瘤组织中的表达情况以及进一步证实其在体内对GPX1活性的抑制作用,同时分析SBP1的表达高低与肝细胞肝癌临床病理特征和预后的关系。选用新鲜切除的肝癌标本19例,其中无血管侵犯9例,有血管侵犯10例,应用Westernblot技术验证其中SBP1蛋白表达情况,比较两组间SBP1蛋白水平的表达差异,同时测定各样本GPX1的活性。在323例肝细胞癌组织构建的组织芯片中应用免疫组化方法检测SBP1蛋白的表达,比较分析肝癌组织中SBP1表达与临床病理特征以及生存、复发的关系,分析比较肝癌组织中SBP1表达与术后肿瘤复发转移的相关性,评估SBP1作为肝癌预后判断指标的价值。结果发现,无血管侵犯的标本中,SBP1的表达量要显著高于有血管侵犯的组别(P<0.05),同时标本中GPX1的活性与SBP1的表达呈负相关。组织芯片结果显示,肝癌组织中SBP1蛋白的表达水平与年龄、术前AFP、肿瘤大小、肿瘤数量、肿瘤包膜、血管侵犯、肿瘤复发有关(P<0.05)。多因素分析显示,性别、血清ALB、肿瘤分化程度、肿瘤包膜、肿瘤大小、血管侵犯与SBP1表达水平为影响患者总体生存率(overallsurvival,OS)的独立预后因素；性别、血清ALT、肿瘤包膜、肿瘤大小、血管侵犯与SBP1表达水平为影响患者复发率的独立预后因素。Kaplan-Meier法分析结果显示,SBP1低表达组预后显著差于SBP1高表达组。在SBP1低表达的病例中,69.08%的患者肿瘤复发,其中早期复发的病例占到了55.07%；而在SBP1高表达组中,50.86%的患者肿瘤复发,早期复发的病例仅占28.45%。利用米兰标准将患者分层后进一步的分析提示,SBP1对于超出米兰标准病例的预后有更大的预测意义。研究结果表明,SBP1的低表达与肝细胞癌的侵袭、转移及不良预后相关。SBP1的表达是肝癌患者预后的独立预测指标,特别是中晚期的肝癌。结论1.SBP1在大多数人肝癌细胞系中低表达,尤其是转移潜能较高的细胞系中：而在正常肝细胞中高表达。2.减少SBP1的表达可以促进肿瘤细胞的迁移,同时帮助肿瘤细胞在受到氧自由基攻击时保持增殖能力并且逃避凋亡。3.SBP1可以抑制GPX1的活性、上调HIF-1a的表达,从而通过调节肿瘤氧化还原微环境来实现其抑癌作用。4.SBP1的低表达与肝细胞癌的侵袭、转移及不良预后相关。SBP1的表达是肝癌患者预后的独立预测指标,特别是在中晚期的肝癌患者中。创新点1.SBP1的促氧化作用可能是其抑制肿瘤的重要机制。2.首次发现并报道SBP1与肝癌预后密切相关。肝癌组织中SBP1的表达可用于指导肝癌的个体化治疗。潜在应用价值1.SBP1低表达是肝癌患者术后复发转移的独立预测指标,可用于临床筛选高危复发患者和指导术后监测与治疗。2.可用于指导肝癌患者的个体化治疗,SBP1高表达的患者可能对放化疗等治疗手段更加敏感。3.在肝癌患者特别是晚期肝癌患者中,抗氧化剂如谷胱甘肽的使用应当特别小心。
【作者】丁光宇；
【导师】樊嘉；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】肝细胞癌；硒结合蛋白1；缺氧诱导因子-1α；谷胱甘肽过氧化物酶；氧应激；

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